Prevalencia de virus de ARN en tubérculos-semilla certificados de Solanum tuberosum cv. Diacol Capiro de la sabana Cundiboyacense

La papa (Solanum tuberosum) Diacol Capiro es uno de los cultivares con mayor producción y consumo interno en Colombia, siendo los departamentos de Cundinamarca y Boyacá, los principales productores. Este cultivo, se ve afectado por un complejo de virus, que disminuye la calidad de los tubérculos y los rendimientos. En este trabajo, se evaluó la prevalencia de los virus de ARN: PLRV, PVY, PVX, PVS, PVV, PYVV, PMTV y PVB, en brotes de tubérculos-semilla certificados, provenientes de la sabana Cundiboyacense, mediante RT-qPCR. Los resultados revelan la ocurrencia de siete de los ochos virus en las muestras, con niveles de infección de 100 % (PVS, PVX y PYVV), 75 % (PLRV), 50 % (PVY), 37,5 % (PMTV) y 12,5 % (PVB). Adicionalmente, con el fin de obtener información de los genomas de los virus detectados, se utilizó secuenciación de alto rendimiento (HTS), de una muestra compuesta (bulk) de brotes, siendo posible obtener el genoma completo del PLRV y el genoma parcial del PVY. Los análisis filogenéticos realizados con dichas secuencias ubicaron a los virus PLRV y PVY en clados, conformados por aislamientos colombianos, con niveles de identidad superiores al 97 %. Estos hallazgos evidencian la necesidad de fortalecer los programas de certificación de tubérculos-semilla de papa en el país, mediante la utilización de pruebas moleculares de detección viral.

Diacol-Capiro is one of the most important potato (Solanum tuberosum) cultivars in Colombia with most production concentrated in the provinces of Cundinamarca and Boyacá. Unfortunately, this crop is seriously affected by several viruses that compromise the quality of tubers and yields. In this work, it was evaluated the prevalence of the RNA viruses: PLRV, PVY, PVX, PVS, PVV, PYVV, PMTV, and PVB in certified tuber-seed sprouts produced in the highlands of Cundinamarca and Boyacá by RT-qPCR. Results revealed a prevalence of 100 % for PVS, PVX, and PYVV; 75 % for PLRV, 50 % for PVY, 37.5 % for PMTV, and 12.5 % for PVB. Additionally, high-throughput sequencing from a sprout´s bulk sample was used to gather genomic information of infecting viruses, which resulted in a partial PVY sequence, and a complete PLRV genome. Phylogenetic analysis revealed that both assemblies cluster within clades comprising other Colombian isolates with more than 97 % nucleotide sequence identity. These findings highlight the need to update potato seed-tuber certification programs in Colombia with the implementation of more sensitive molecular tests.

COINFECCIÓN NATURAL DE VIRUS DE ARN EN CULTIVOS DE PAPA (Solanum tuberosum subsp. Andigena) EN ANTIOQUIA (COLOMBIA) / Natural coinfection of RNA viruses in potato (Solanum tuberosum subsp. Andigena) crops in Antioquia (Colombia)

RESUMEN Las enfermedades virales son uno de los principales problemas fitopatológicos de la papa. Con el fin de determinar los virus más prevalentes en cultivos de papa var. Diacol Capiro en el oriente Antioqueño (Colombia), se evaluó mediante RT-qPCR la presencia de diez virus de ARN (PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV y PMTV) en 36 muestras de tejido foliar. Los resultados indicaron la ocurrencia de cinco de los diez virus evaluados, con niveles de prevalencia de 88,9 %, 75 %, 75 %, 41,7 % y 25 % para PVY, PVX, PYVV, PLRV y PVS, respectivamente. Con fines comparativos, cuatro virus también se evaluaron mediante ELISA, siendo detectados PVS (80,5 %), PVY (55 %) y PLRV (5,5 %); mientras que PVX no fue encontrado con esta prueba. La comparación de estas técnicas mediante la razón de prevalencia (RP), indicó que la RT-qPCR ofrece niveles superiores de detección con valores de RP = 1,6 y RP = 7,5 para los virus PVY y PLRV; mientras que para PVS la ELISA detectó más muestras positivas que RT-qPCR (RP = 3,22), evidenciándose la necesidad de diseñar nuevos cebadores ajustados a la diversidad de este virus en Antioquia. La coinfección mixta más frecuente fue PVY-PYVV-PVX (22,2 %), mientras que los cinco virus se encontraron en el 11,1 % de las muestras. Finalmente, utilizando secuenciación Sanger de la cápside y NGS para los genomas completos, se confirmó la circulación de todos los virus detectados en los cultivos de papa del oriente Antioqueño. Estos resultados señalan la necesidad de fortalecer los programas de manejo integrado de enfermedades virales en Antioquia.

ABSTRACT Viral diseases are one of the main phytopathological problems affecting potato crops worldwide. To determine the most prevalent viruses in potato var. Diacol Capiro crops in Eastern Antioquia, 36 leaf samples were tested for the presence of PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV and PMTV using RT-qPCR. Detected viruses included PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS with prevalence levels of 88.9 %, 75.0 %, 75.0 %, 41.7 % and 25.0 %, respectively. PVS, PVY, PLRV and PVX were also tested by ELISA. PVS, PVY and PLRV tested positive in 80.5 %, 55.0 % and 5.5 % of samples; PVX was not detected. Prevalence Ratios (PR) suggests that detection is higher for PVY (PR = 1.6) and PLRV (PR = 7.5) using RT-qPCR. ELISA worked better for PVS with a PR of 3.2; this result suggests that the RT-qPCR primers used for PVS must be adjusted to reflect the genome diversity of virus in Antioquia. The most frequent coinfection was PVY-PYVV-PVX, which occurred in 22.2 % of samples; coinfection with PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS was present in 11.1 % of samples. The circulation of these viruses in Eastern Antioquia was further confirmed using Sanger and high-throughput sequence. This work highlights the need to strengthen integrated disease management programs of viruses in Antioquia.

Design of primers for specific detection of Potato Virus Y (PVY) by RT-PCR / Diseño de cebadores específicos para la detección por rt-pcr del potato virus y (pvy)

RESUMEN El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes para la producción de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo. Este virus es transmitido por tubérculo-semilla de papa y por diferentes especies de áfidos. Para su manejo es fundamental la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral, para lo que se requieren metodologías de detección altamente sensibles como ELISA y RT-PCR. Para éstas últimas pruebas, es necesario disponer de cebadores específicos que permitan el diagnóstico del virus en tejidos asintomáticos. En este estudio se reportan los cebadores PVY_Col para la detección del PVY en RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). Estos cebadores fueron diseñados con base en las secuencias de este virus que se han reportado en Colombia sobre diferentes hospedantes, así como de las diferentes variantes encontradas en el mundo. Una particularidad adicional de estos cebadores es que no presentan reacción cruzada con el genoma del Potato virus V (PVV), otro potyvirus que recientemente se ha encontrado afectando cultivos de papa en Colombia. Se espera que los cebadores PVY_Col sean utilizados para apoyar los programas de certificación de material de siembra de papa, así como para adelantar estudios epidemiológicos y de manejo fitosanitario de este virus.

ABSTRACT Potato virus Y (PVY) is one of the most limiting viruses in the production of potato (Solanum tuberosum and S. phureja) worldwide. This virus is transmitted by aphids and infected tuber-seeds, and for this reason, disease management of PVY requires, among others, using certified planting material through highly sensitive techniques such as ELISA and RT-PCR. However, RT-PCR-based methods require primers of high specificity to allow the unequivocal detection of viruses in asymptomatic tissues. In this work, we report a new set of primers (PVY_Col) for detection of PVY by RT-PCR and real-time RT-PCR (RT-qPCR). These primers were designed using sequences of PVY isolates from Colombia and the rest of the world. An essential feature of these primers is their specificity, since they don't amplify templates from Potato virus V (PVV), a close PVY relative that also infects potato crops in Colombia. It is expected that the PVY_Col primer set will be useful to support potato seed certification programs, epidemiological studies, and PVY disease management programs.

Characterization of the genome of a novel ilarvirus naturally infecting Cape gooseberry (Physalis peruviana).

As part of an initiative to characterize viruses infecting Cape gooseberry in the province of Antioquia (Colombia), we report the genome sequence of a new member of the genus Ilarvirus (family Bromoviridae). This virus was identified in a Cape gooseberry plot in the municipality of Marinilla in a mixed infection with potato virus Y (PVY) as part of high-throughput sequencing initiative. Results were confirmed by nested RT-PCR and DAS-ELISA. Phylogenetic analysis suggested that the Cape gooseberry ilarvirus is a new member of subgroup 1 and it is most closely related to ageratum latent virus (AgLV). The name "Cape gooseberry ilarvirus 1" (CGIV-1) is proposed for this new ilarvirus.

Generación de anticuerpos policlonales para la detección de la variante genotípica GIII de PVY, en cultivos de tomate de Árbol y papa de Colombia / Generation of policlonal antibodies for detection of the PVY genotypic variant GIII in tamarillo and potato crops from Colombia

El potyvirus PVY es uno de los agentes causales más frecuentemente asociados a problemas virales en cultivos de papa y tomate de árbol en Colombia. Dada la importancia económica de las enfermedades causadas por PVY y a la necesidad de generar material de siembra certificado por su sanidad viral, es fundamental la generación de herramientas de diagnóstico que permitan la detección temprana de este virus. En este trabajo se reporta la obtención de anticuerpos policlonales específicos, útiles para la detección del genotipo III de PVY (GIII), una de las tres variantes que recientemente han sido reportadas en cultivos de papa y tomate de árbol de la región Andina de Colombia. Como antígeno, se utilizó un péptido sintético diseñado a partir de la región variable del extremo N-terminal del gen de la cápside viral. La sensibilidad de los anticuerpos fue evaluada mediante pruebas de ELISA y dot-blot utilizando péptidos sintéticos. Se realizó una prueba piloto para validar el uso de los anticuerpos a partir de plantas sintomáticas y asintomáticas obtenidas de una región donde confluyen cultivos de ambas solanéceas, encontrándose que los anticuerpos generados ofrecen mayores niveles de detección que los anticuerpos comerciales comúnmente utilizados para detectar los serotipos PVY-O,C y PVY-N de este virus.

PVY is one of the potyvirus more frequently associated with viral infections in tomato and tamarillo crops in Colombia. Due to the economic impact of PVY and the need to certify seeds as virus-free it is important to develop diagnostic tools that allow its premature detection. In this work, the obtention of antibodies detecting the genotype III of PVY is reported. This genotype is one of the three PVY variants infecting tamarillo and potato in the Andean region of Colombia. The N-terminal variable region of the coat protein was chosen as antigen for antibody production. The sensibility of these antibodies was tested by ELISA and dot-blot using synthetic peptides. A pilot test was performed on symptomatic and non-symptomatic plants from a mixed orchard of tamarillo and potato. The generated antibodies showed higher detection levels than the commercial antibodies commonly used to detect the PVY-O,C and PVY-N serotypes.

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA LA DETECCIÓN DEL Tamarillo leaf malformation virus (TALMV) EN TOMATE DE ÁRBOL / Specific Antibodies to Detect Tamarillo leaf malformation virus (TaLMV) in Tamarillo

En Colombia el rendimiento del cultivo de tomate de árbol se ha visto seriamente afectado por la expansión de una enfermedad conocida como virosis de tomate de árbol. Esta patología se registró inicialmente en 1991 en el norte de Antioquia y su expansión ha alcanzado todas las regiones cultivadoras de este frutal en el país. Trabajos recientes han detectado la presencia de por lo menos dos especies del género Potyvirus (Potyviridae) asociadas a esta enfermedad en los cultivos de tomate de árbol de Antioquia: Potato virus Y (PVY) y Tamarillo leaf malformation virus (TaLMV, especie propuesta). Con el fin de reducir la diseminación de estos patógenos virales en el país, es necesario contar con herramientas de diagnóstico que permitan la certificación del material de siembra y la detección temprana en plantas asintomáticas. En este trabajo se obtuvieron anticuerpos policlonales específicos para la detección del virus TaLMV utilizando una región antigénica de 15 residuos de la cápside viral. La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos anti-TaLMV fue evaluada mediante pruebas de ELISA y dot-blot utilizando proteína recombinante y péptidos sintéticos como controles. La utilidad de estos anticuerpos fue validada a partir de una prueba piloto de detección de TaLMV en muestras de plantas de tomate de árbol con y sin síntomas de virosis obtenidas en el oriente antioqueño. Los resultados serológicos fueron comparados con los niveles de detección que ofrece la técnica de RT-PCR con cebadores específicos para la cápside viral de TaLMV.

In Colombia, yields of tamarillo are seriously affected by a complex viral disease known as virosis. This pathology was first reported in 1991 in the north of Antioquia and currently affects all tamarillo growing regions in the country. Recent works have demonstrated the association of two potyviruses (potyviridae) with this disease: Potato virus Y (PVY) and Tamarillo leaf malformation virus (TaLMV, proposed species). Specific diagnostic tools are required for early asymptomatic detection of these viruses and tamarillo certification programs. In this study, we report the obtention of TaLMV specific antibodies using a 15 residues peptide mimicking the N-terminal coat protein. Specificity and sensitivity of the anti-TaLMV antibodies was determined by ELISA and dot-blot using recombinant protein and synthetic peptides as controls. The usefulness of these antibodies was validated from a preliminary trial of TaLMV detection in plant samples obtained from tamarillo crops in eastern Antioquia and results were compared with a TaMLV specific coat RT-PCR detection protocol.